1 イントロダクション:サブクラス解析の重要性

Part 1では、データセット全体から「T細胞」という大きなグループを特定し、抽出しました。 しかし、一口にT細胞と言っても、その中には免疫を司令するヘルパーT細胞(CD4+)、攻撃を担うキラーT細胞(CD8+)、過剰な免疫を抑える制御性T細胞(Treg)など、多様な役割を持つ細胞が混ざっています。

1.0.1 なぜ再計算が必要なのか?

全体解析で見つかった「高変動遺伝子(Variable Features)」は、T細胞とB細胞やマクロファージを分けるための遺伝子が中心です。 T細胞の内部にあるわずかな違いを浮き彫りにするためには、T細胞の中だけで遺伝子のばらつきを計算し直す必要があります。


2 データの読み込み

前回保存したT細胞のサブセットデータを読み込みます。

# 保存したRDSファイルを読み込み
t_cells <- readRDS("./JIAsyno_CITEseq_T_share.rds")

# 読み込んだデータの確認(細胞数やAssayの種類を確認)
t_cells
## An object of class Seurat 
## 30940 features across 11058 samples within 2 assays 
## Active assay: RNA (30803 features, 2000 variable features)
##  3 layers present: counts, data, scale.data
##  1 other assay present: ADT
##  2 dimensional reductions calculated: pca, umap

3 サブセットに対する再解析パイプライン

T細胞集団に対して、改めて「特徴探し」から「分類」までを行います。

3.0.1 1. 高変動遺伝子の再選出

T細胞のサブタイプ(CD4, CD8, Tregなど)を区別するために重要な遺伝子を新たに選びます。

# ターゲットをRNAに設定
DefaultAssay(t_cells) <- "RNA"

# T細胞の中での高変動遺伝子を特定
t_cells <- FindVariableFeatures(t_cells, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# 上位の変動遺伝子をプロット
top10_t <- head(VariableFeatures(t_cells), 10)
LabelPoints(plot = VariableFeaturePlot(t_cells), points = top10_t, repel = TRUE)

3.0.2 2. スケーリングとPCA(主成分分析)

T細胞内の差異に基づいた新しい「軸(主成分)」を作成します。

t_cells <- ScaleData(t_cells)
t_cells <- RunPCA(t_cells, features = VariableFeatures(object = t_cells))

# 実際の主成分をプロットして確認
## ここでの色はT細胞以外の細胞を含めてクラスタリングしたときの情報です
DimPlot(t_cells, reduction = "pca") + NoLegend()

# どの主成分までが重要か、エルボープロットで確認
ElbowPlot(t_cells)

3.0.3 3. クラスタリングとUMAPによる可視化

T細胞の中での「似た者同士」をグループ化します。

# PC1から10までを使用して計算
t_cells <- FindNeighbors(t_cells, dims = 1:10)

# resolution(解像度)を調整することで、クラスターの細かさを変えられます
# 今回は少し細かめに 0.8 に設定してみます
t_cells <- FindClusters(t_cells, resolution = 0.8)
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
## 
## Number of nodes: 11058
## Number of edges: 365998
## 
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8853
## Number of communities: 18
## Elapsed time: 0 seconds
# UMAPの計算
t_cells <- RunUMAP(t_cells, dims = 1:10)

# 結果の描画
DimPlot(t_cells, reduction = "umap", label = TRUE) 


4 生物学的な解釈:このT細胞は何者か?

各クラスターがどのようなT細胞なのか、代表的なマーカー遺伝子の発現を見てみましょう。

  • CD4: ヘルパーT細胞
  • CD8A: キラーT細胞
  • CCR7: ナイーブT細胞
  • FOXP3: 制御性T細胞 (Treg)
  • KLRB1: メモリーT細胞のマーカー
  • TRAV1-2 / SLC4A10: MAIT細胞
  • CXCL13: Follicular helper T細胞 (Tfh)/ Peripheral helper T細胞 (Tph)
  • NCAM1 / FCGR3A: NK細胞
  • GZMB / PRF1: 細胞傷害活性(キラー能力)を持つ細胞-1
  • GZMK: 細胞傷害性T細胞-2
  • TRDV2 / TRGV9: γδ T細胞
  • ZNF683 / KLRC2: 組織常在性メモリーT細胞 (TRM)

T細胞アノテーションのコツ まず、T細胞を大きく「CD4陽性」と「CD8陽性」に分け、その後にTregやMAIT、NKTなどの特殊なサブタイプを見ていくと良いでしょう。

なぜNK細胞のマーカーを見るのか? NK細胞はT細胞と共通の前駆細胞から分化し、かつ遺伝子発現状態が連続的につながっているため、T細胞集団に混入していることがあります。特にCD8陽性T細胞とNK細胞は一部マーカーが重複するため、注意が必要です。

# マーカー遺伝子の発現を地図(UMAP)上にプロット
features_to_plot <- c("CD3E", "CD4", "CD8A", "CCR7", "FOXP3", "KLRB1", 
                      "TRAV1-2", "SLC4A10", "CXCL13", 
                      "NCAM1", "FCGR3A", 
                      "GZMB", "PRF1", "GZMK", 
                      "TRDV2", "TRGV9", 
                      "ZNF683", "KLRC2")
FeaturePlot(t_cells, features = features_to_plot, ncol = 4)

4.0.1 クラスターごとの発現比較(バイオリンプロット)

数値的な違いをより明確に確認します。

VlnPlot(t_cells, features = features_to_plot, pt.size = 0, ncol = 2)

既存のマーカーの発現以外に、データドリブンで各クラスターの特徴的な遺伝子を調べることも有効です。

t_markers = FindAllMarkers(t_cells, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
t_markers %>% 
  dplyr::group_by(cluster) %>% 
  dplyr::top_n(n = 8, wt = avg_log2FC) %>%
  as.data.frame()
##             p_val avg_log2FC pct.1 pct.2     p_val_adj cluster       gene
## 1   1.452093e-249   1.488029 0.807 0.480 4.472882e-245       0      NOSIP
## 2   1.361467e-230   1.544624 0.669 0.286 4.193727e-226       0       CCR7
## 3   5.819414e-202   1.796984 0.539 0.211 1.792554e-197       0        MAL
## 4   2.072956e-176   1.918416 0.408 0.130 6.385325e-172       0       FHIT
## 5   1.745770e-120   1.561202 0.470 0.225 5.377494e-116       0        MYC
## 6   1.785822e-113   1.781299 0.354 0.138 5.500868e-109       0    TRABD2A
## 7    6.781884e-71   1.359480 0.399 0.222  2.089024e-66       0 AC243960.1
## 8    6.444095e-69   1.673788 0.267 0.112  1.984975e-64       0      ACTN1
## 9   8.387867e-146   1.123077 0.924 0.694 2.583715e-141       1        LTB
## 10  5.609748e-132   1.623222 0.526 0.213 1.727971e-127       1       AQP3
## 11  4.280458e-108   1.348620 0.408 0.142 1.318509e-103       1        CD4
## 12   5.974422e-92   1.406259 0.459 0.202  1.840301e-87       1      TRADD
## 13   1.612873e-86   1.100976 0.490 0.224  4.968134e-82       1      TIMP1
## 14   5.828424e-56   1.286947 0.327 0.147  1.795329e-51       1   TNFRSF25
## 15   2.003784e-49   1.183526 0.367 0.186  6.172255e-45       1      LIMS1
## 16   6.814259e-38   1.180272 0.268 0.129  2.098996e-33       1       PASK
## 17   0.000000e+00   2.657202 0.841 0.243  0.000000e+00       2       CD8A
## 18   0.000000e+00   2.373755 0.784 0.217  0.000000e+00       2       CD8B
## 19   0.000000e+00   2.340439 0.783 0.243  0.000000e+00       2       GZMK
## 20   0.000000e+00   2.383701 0.658 0.157  0.000000e+00       2       GZMH
## 21  1.200088e-298   2.750063 0.556 0.116 3.696631e-294       2       LAG3
## 22  4.793321e-190   2.359342 0.415 0.094 1.476487e-185       2   HLA-DRB5
## 23  2.051888e-178   2.249384 0.437 0.107 6.320432e-174       2    HLA-DRA
## 24  3.221928e-160   2.186696 0.451 0.126 9.924506e-156       2       PTMS
## 25   0.000000e+00   5.237402 0.520 0.018  0.000000e+00       3      TRDV2
## 26   0.000000e+00   3.783232 0.504 0.061  0.000000e+00       3      TRGV9
## 27  4.069359e-254   2.453918 0.592 0.156 1.253485e-249       3      KLRG1
## 28  1.386016e-158   2.206775 0.307 0.057 4.269344e-154       3     ZBTB16
## 29  2.446471e-147   1.782404 0.414 0.108 7.535865e-143       3       PLEK
## 30  1.200782e-134   1.993738 0.415 0.119 3.698769e-130       3      MYBL1
## 31  5.954040e-122   1.817187 0.258 0.050 1.834023e-117       3      S1PR5
## 32   3.238299e-89   1.805637 0.291 0.083  9.974933e-85       3    C1orf21
## 33   0.000000e+00   2.485121 0.930 0.214  0.000000e+00       4       CD8B
## 34   0.000000e+00   3.223103 0.718 0.092  0.000000e+00       4  LINC02446
## 35   0.000000e+00   4.140657 0.294 0.016  0.000000e+00       4       NT5E
## 36  3.315425e-295   2.757895 0.537 0.087 1.021250e-290       4       AIF1
## 37  1.267340e-230   2.279822 0.511 0.105 3.903786e-226       4      ACTN1
## 38  1.840290e-218   2.011196 0.618 0.165 5.668644e-214       4      NELL2
## 39  4.573007e-187   2.799118 0.284 0.037 1.408623e-182       4      LRRN3
## 40  5.622938e-170   1.848587 0.529 0.141 1.732033e-165       4    TRABD2A
## 41   0.000000e+00   6.034507 0.807 0.032  0.000000e+00       5     FCGR3A
## 42   0.000000e+00   5.856208 0.834 0.062  0.000000e+00       5      SPON2
## 43   0.000000e+00   5.438919 0.814 0.048  0.000000e+00       5     FGFBP2
## 44   0.000000e+00   4.899510 0.627 0.031  0.000000e+00       5      KLRF1
## 45   0.000000e+00   5.562712 0.496 0.019  0.000000e+00       5     CX3CR1
## 46   0.000000e+00   5.246828 0.439 0.019  0.000000e+00       5     PRSS23
## 47   0.000000e+00   5.181054 0.383 0.021  0.000000e+00       5     AKR1C3
## 48   0.000000e+00   5.311373 0.345 0.022  0.000000e+00       5      MYOM2
## 49  1.877812e-277   3.307008 0.444 0.058 5.784226e-273       6      FXYD2
## 50  1.115310e-269   2.826102 0.609 0.122 3.435490e-265       6     ZNF683
## 51  5.236125e-229   3.638342 0.312 0.033 1.612884e-224       6      TRDV1
## 52  5.900723e-161   2.485535 0.485 0.117 1.817600e-156       6      KLRC2
## 53  1.769435e-105   1.983293 0.420 0.119 5.450391e-101       6  LINC02446
## 54   7.206443e-73   1.986776 0.335 0.105  2.219801e-68       6      RRAS2
## 55   2.375158e-67   1.976763 0.345 0.120  7.316199e-63       6     SPINT2
## 56   5.472146e-60   2.003276 0.273 0.082  1.685585e-55       6   IFNG-AS1
## 57   0.000000e+00   2.709259 0.854 0.197  0.000000e+00       7       FOSB
## 58  3.217484e-296   2.410720 0.989 0.405 9.910815e-292       7        FOS
## 59  4.161942e-257   2.377660 0.816 0.249 1.282003e-252       7       CREM
## 60  3.515260e-230   2.321351 0.951 0.529 1.082805e-225       7    TNFAIP3
## 61  1.071982e-180   2.893513 0.369 0.055 3.302026e-176       7     CDKN1A
## 62  9.548864e-177   2.367896 0.519 0.120 2.941337e-172       7     CSRNP1
## 63  1.406000e-149   2.337080 0.476 0.118 4.330902e-145       7       RGS2
## 64  3.060242e-127   2.767755 0.283 0.048 9.426463e-123       7       ATF3
## 65   0.000000e+00   2.684021 0.744 0.137  0.000000e+00       8       FHIT
## 66  2.186269e-228   2.215965 0.559 0.104 6.734364e-224       8      PLCL1
## 67  4.853353e-222   3.388579 0.289 0.026 1.494978e-217       8 AL589693.1
## 68  6.584765e-209   2.524472 0.454 0.073 2.028305e-204       8   LEF1-AS1
## 69  1.827189e-194   2.846443 0.292 0.031 5.628290e-190       8    ANKRD55
## 70  1.208567e-186   2.386368 0.389 0.059 3.722749e-182       8        AK5
## 71  1.335474e-166   2.306940 0.353 0.054 4.113662e-162       8      ADTRP
## 72  9.660521e-144   2.575178 0.274 0.038 2.975730e-139       8      PCSK5
## 73   0.000000e+00   2.997910 0.937 0.137  0.000000e+00       9     TYROBP
## 74   0.000000e+00   3.198042 0.849 0.231  0.000000e+00       9       GNLY
## 75   0.000000e+00   3.835183 0.651 0.068  0.000000e+00       9      KLRC1
## 76  5.142313e-305   4.400241 0.311 0.020 1.583987e-300       9    KIR2DL4
## 77  1.118948e-304   3.864970 0.363 0.029 3.446696e-300       9      NCAM1
## 78  1.389849e-280   3.581162 0.398 0.041 4.281152e-276       9     ATP8B4
## 79  3.353852e-208   3.626918 0.298 0.030 1.033087e-203       9      ITGAX
## 80  6.436316e-136   3.092236 0.266 0.035 1.982578e-131       9        GSN
## 81   0.000000e+00   5.776996 0.518 0.022  0.000000e+00      10     CXCL13
## 82   0.000000e+00   4.218815 0.476 0.022  0.000000e+00      10     PTPN13
## 83   0.000000e+00   4.057884 0.420 0.031  0.000000e+00      10  LINC00892
## 84  3.034151e-276   3.275340 0.420 0.041 9.346097e-272      10       TOX2
## 85  1.768715e-251   3.608642 0.314 0.023 5.448173e-247      10       ETV7
## 86  2.685888e-228   3.611146 0.334 0.031 8.273341e-224      10    GADD45G
## 87  1.667778e-210   3.682664 0.258 0.019 5.137255e-206      10      MYO7A
## 88  6.280697e-149   3.718157 0.256 0.028 1.934643e-144      10        NMB
## 89   0.000000e+00   6.387240 0.755 0.016  0.000000e+00      11      FOXP3
## 90   0.000000e+00   4.916334 0.476 0.033  0.000000e+00      11      IL2RA
## 91  7.505495e-299   3.383085 0.685 0.114 2.311918e-294      11      CTLA4
## 92  4.622075e-237   4.181195 0.262 0.016 1.423738e-232      11       LAYN
## 93  3.440854e-224   3.458952 0.427 0.052 1.059886e-219      11      RTKN2
## 94  7.695887e-211   3.254710 0.410 0.051 2.370564e-206      11       NCF4
## 95  5.061275e-148   3.386722 0.273 0.031 1.559025e-143      11         F5
## 96  4.305182e-106   3.526452 0.366 0.081 1.326125e-101      11       HPGD
## 97   0.000000e+00   4.584770 0.459 0.029  0.000000e+00      12     TNFSF9
## 98  8.334722e-216   3.577250 0.802 0.208 2.567344e-211      12       CCL4
## 99  5.797459e-137   3.439870 0.402 0.069 1.785791e-132      12       IFNG
## 100 3.498851e-136   2.738785 0.451 0.086 1.077751e-131      12      NR4A3
## 101 1.571180e-134   3.895646 0.371 0.058 4.839706e-130      12     CCL4L2
## 102 6.390201e-127   2.868786 0.368 0.059 1.968374e-122      12   HLA-DQA1
## 103  8.836986e-90   2.939809 0.337 0.070  2.722057e-85      12      CRTAM
## 104  4.691698e-82   2.716458 0.322 0.070  1.445184e-77      12      IER5L
## 105  0.000000e+00   3.868298 0.684 0.059  0.000000e+00      13      FXYD2
## 106 2.689449e-275   2.847425 0.740 0.117 8.284310e-271      13      KLRC2
## 107 3.002981e-210   2.890208 0.663 0.127 9.250082e-206      13       AREG
## 108 5.477543e-201   3.655236 0.372 0.038 1.687247e-196      13      TRDV1
## 109 5.307458e-180   4.035854 0.276 0.022 1.634856e-175      13       KLF4
## 110 3.444784e-156   4.061209 0.265 0.023 1.061097e-151      13       PLK2
## 111 1.143226e-130   3.053326 0.265 0.029 3.521478e-126      13      SPRY2
## 112 1.792414e-125   3.390112 0.288 0.038 5.521172e-121      13        GEM
## 113  8.577664e-74   3.948375 0.302 0.054  2.642178e-69      14 AC016831.7
## 114  1.953122e-60   3.324848 0.617 0.311  6.016203e-56      14     CHST11
## 115  1.307790e-49   3.327553 0.510 0.228  4.028386e-45      14      ATXN1
## 116  1.893749e-39   3.317182 0.328 0.104  5.833314e-35      14     ZNF407
## 117  1.340319e-30   3.300858 0.282 0.092  4.128584e-26      14       ATG7
## 118  1.924731e-28   3.134479 0.315 0.121  5.928750e-24      14      TRPS1
## 119  1.658359e-27   3.307763 0.273 0.094  5.108243e-23      14     ZSWIM6
## 120  3.755792e-27   3.112201 0.347 0.150  1.156897e-22      14      MGAT5
## 121 2.632881e-247   3.797971 0.862 0.134 8.110063e-243      15       XCL1
## 122 7.243149e-237   5.088743 0.792 0.130 2.231107e-232      15       AREG
## 123 1.934716e-219   3.793470 0.712 0.100 5.959507e-215      15      NR4A1
## 124 1.894780e-206   4.061271 0.762 0.129 5.836490e-202      15       XCL2
## 125 5.436837e-195   4.431189 0.323 0.020 1.674709e-190      15      KRT86
## 126 2.253200e-134   3.853521 0.769 0.217 6.940532e-130      15       CCL4
## 127 4.438854e-103   4.470166 0.338 0.044  1.367300e-98      15       CCL3
## 128  8.504690e-68   3.685516 0.369 0.073  2.619700e-63      15       CD83
## 129  0.000000e+00   8.780390 0.751 0.003  0.000000e+00      16       RRM2
## 130  0.000000e+00  11.126834 0.574 0.001  0.000000e+00      16      UBE2C
## 131  0.000000e+00   9.926383 0.541 0.001  0.000000e+00      16      BIRC5
## 132  0.000000e+00   8.864625 0.440 0.001  0.000000e+00      16      MYBL2
## 133  0.000000e+00  10.851496 0.402 0.000  0.000000e+00      16      SPC25
## 134  0.000000e+00   8.822303 0.383 0.002  0.000000e+00      16      CCNB2
## 135  0.000000e+00   9.491492 0.340 0.000  0.000000e+00      16      HJURP
## 136  0.000000e+00  10.465019 0.311 0.000  0.000000e+00      16     DLGAP5
## 137  1.532190e-66   4.129490 0.750 0.040  4.719604e-62      17      MYOM2
## 138  2.889103e-29   2.345311 0.833 0.107  8.899303e-25      17      SPON2
## 139  4.506285e-28   2.434113 0.708 0.077  1.388071e-23      17     FCGR3A
## 140  2.254802e-20   3.088388 0.250 0.015  6.945467e-16      17      NMUR1
## 141  1.970125e-16   2.384756 0.417 0.047  6.068576e-12      17     CX3CR1
## 142  2.809336e-12   2.491478 0.333 0.040  8.653599e-08      17 AL589693.1
## 143  4.336779e-09   2.401853 0.333 0.047  1.335858e-04      17        GSN
## 144  5.470198e-06   2.338720 0.250 0.048  1.684985e-01      17 CYB561D2.1
DoHeatmap(t_cells, features = t_markers %>% 
            dplyr::group_by(cluster) %>% 
            dplyr::top_n(n = 8, wt = avg_log2FC) %>%
            dplyr::pull(gene) %>%
            unique()) 


5 クラスターの同定とラベル貼り(実習パート)

解析の結果をもとに、クラスター番号を生物学的な名前に書き換えます。

論文内のアノテーションとの一致を確認します。


6 まとめと考察

サブクラス解析を行うことで、全体の解析では一つの「T細胞」という塊だったものが、実は多様な集団の集まりであることが分かりました。 自己免疫疾患(今回はJIA)の炎症部位において、「どのT細胞サブセットが特に活性化しているのか」、あるいは「治療によってどの集団が減るのか」を詳細に追跡することが、病態理解の鍵となります。

6.0.1 学生への課題

  1. resolution を 0.2 や 1.5 に変えると、クラスターの数はどう変化しますか?

7 セッション情報

sessionInfo()
## R version 4.3.2 (2023-10-31)
## Platform: aarch64-apple-darwin20 (64-bit)
## Running under: macOS 26.2
## 
## Matrix products: default
## BLAS:   /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.3-arm64/Resources/lib/libRblas.0.dylib 
## LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.3-arm64/Resources/lib/libRlapack.dylib;  LAPACK version 3.11.0
## 
## locale:
## [1] en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/C/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8
## 
## time zone: Asia/Tokyo
## tzcode source: internal
## 
## attached base packages:
## [1] stats     graphics  grDevices utils     datasets  methods   base     
## 
## other attached packages:
## [1] patchwork_1.1.3    magrittr_2.0.3     Seurat_5.2.1       SeuratObject_5.0.2
## [5] sp_2.1-2           BiocStyle_2.30.0  
## 
## loaded via a namespace (and not attached):
##   [1] RColorBrewer_1.1-3     rstudioapi_0.15.0      jsonlite_1.8.8        
##   [4] spatstat.utils_3.1-2   ggbeeswarm_0.7.2       magick_2.8.2          
##   [7] farver_2.1.1           rmarkdown_2.25         vctrs_0.6.5           
##  [10] ROCR_1.0-11            spatstat.explore_3.3-4 htmltools_0.5.7       
##  [13] sass_0.4.8             sctransform_0.4.1      parallelly_1.36.0     
##  [16] KernSmooth_2.23-22     bslib_0.6.1            htmlwidgets_1.6.4     
##  [19] ica_1.0-3              plyr_1.8.9             plotly_4.10.3         
##  [22] zoo_1.8-12             cachem_1.0.8           igraph_1.6.0          
##  [25] mime_0.12              lifecycle_1.0.4        pkgconfig_2.0.3       
##  [28] Matrix_1.6-5           R6_2.5.1               fastmap_1.1.1         
##  [31] fitdistrplus_1.1-11    future_1.33.1          shiny_1.8.0           
##  [34] digest_0.6.33          colorspace_2.1-0       tensor_1.5            
##  [37] RSpectra_0.16-1        irlba_2.3.5.1          labeling_0.4.3        
##  [40] progressr_0.14.0       fansi_1.0.6            spatstat.sparse_3.1-0 
##  [43] httr_1.4.7             polyclip_1.10-6        abind_1.4-5           
##  [46] compiler_4.3.2         withr_2.5.2            fastDummies_1.7.3     
##  [49] highr_0.10             MASS_7.3-60            tools_4.3.2           
##  [52] vipor_0.4.7            lmtest_0.9-40          beeswarm_0.4.0        
##  [55] httpuv_1.6.13          future.apply_1.11.1    goftest_1.2-3         
##  [58] glue_1.6.2             nlme_3.1-163           promises_1.2.1        
##  [61] grid_4.3.2             Rtsne_0.17             cluster_2.1.4         
##  [64] reshape2_1.4.4         generics_0.1.3         gtable_0.3.4          
##  [67] spatstat.data_3.1-4    tidyr_1.3.0            data.table_1.16.0     
##  [70] utf8_1.2.4             spatstat.geom_3.3-5    RcppAnnoy_0.0.21      
##  [73] ggrepel_0.9.4          RANN_2.6.1             pillar_1.9.0          
##  [76] stringr_1.5.1          limma_3.58.1           spam_2.10-0           
##  [79] RcppHNSW_0.5.0         later_1.3.2            splines_4.3.2         
##  [82] dplyr_1.1.4            lattice_0.21-9         survival_3.5-7        
##  [85] deldir_2.0-2           tidyselect_1.2.0       miniUI_0.1.1.1        
##  [88] pbapply_1.7-2          knitr_1.45             gridExtra_2.3         
##  [91] bookdown_0.37          scattermore_1.2        xfun_0.41             
##  [94] statmod_1.5.0          matrixStats_1.2.0      stringi_1.8.3         
##  [97] lazyeval_0.2.2         yaml_2.3.8             evaluate_0.23         
## [100] codetools_0.2-19       tibble_3.2.1           BiocManager_1.30.22   
## [103] cli_3.6.2              uwot_0.1.16            xtable_1.8-4          
## [106] reticulate_1.35.0      munsell_0.5.0          jquerylib_0.1.4       
## [109] Rcpp_1.0.11            globals_0.16.2         spatstat.random_3.3-2 
## [112] png_0.1-8              ggrastr_1.0.2          spatstat.univar_3.1-2 
## [115] parallel_4.3.2         ellipsis_0.3.2         ggplot2_3.4.4         
## [118] presto_1.0.0           dotCall64_1.1-1        listenv_0.9.0         
## [121] viridisLite_0.4.2      scales_1.3.0           ggridges_0.5.5        
## [124] purrr_1.0.2            rlang_1.1.2            cowplot_1.1.2

8 使用したデータセットのサイズ一覧の確認(PCのスペックを指示するのに重要)

# mega biteで表示
object.size(t_cells) / 1000 / 1000
## 654.6 bytes